囊胚注射

1．实验器材、仪器和试剂的准备

弯式有齿镊、直式有齿镊、显微镊、手术剪、最小号止血钳、缝合针、5/0丝线及持针器、10cm培养皿、无菌30mm培养皿、电子称、PBS溶液、M16溶液（Sigma）、DMEM、HDMEM、矿物油（Sigma）、75%乙醇、5%氢氟酸、超纯水、移液器、倒置显微镜、解剖显微镜、显微操作仪、超净台、二氧化碳培养箱、拉针仪、煅针仪、磨针仪、酒精灯、自制吸卵针、移植针、持卵针、注射针。

2. 公鼠结扎

同原核注射。

3．供体鼠和受体鼠的准备

① 3周C57母鼠在明暗交替的鼠房内饲养在屏障里5天左右，即可以作为超排的供体鼠用；

② 孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）均用生理盐水溶解，终浓度为100IU/ml，分装后-20℃保存备用，可存放1个月；

③ 每只腹腔注射PMSG 10 IU(0.1ml)，48h后注射hCG后与单笼饲养的6周以上公鼠C57按1:1比例合笼，见栓后3.5天取囊胚；

④ 次日下午取6周龄以上受体鼠ICR或CD1，选择阴道周围组织为粉红色，阴道口背侧唇可见条纹，阴道口腹侧唇可见肿大，阴道有分泌液外渗的发情期母鼠与结扎公鼠合笼，见栓2.5后备用；

4. 取囊胚

① 用M16在30mm培养皿里做10个培养微滴放培养箱备用。

② 将取卵用的器械用酒精棉球消毒处理，在酒精灯上自制好吸卵针，按每只鼠1mlM2和300µlM16置培养箱预热15min；

③ 断颈处死供体鼠，将小鼠置托盘中，酒精消毒后剪开腹部，暴露子宫，镊子夹住子宫，用剪刀划掉与子宫相连的脂肪，再剪断两端子宫与输卵管连接处，最后剪断子宫颈，将取下的子宫放置30mm培养皿中；

④用眼科镊捏住子宫颈，用1ml注射器吸0.5mlPBS对子宫角进行冲洗，待子宫全部冲完之后放到解剖显微镜下将囊胚吸出放入培养微滴备用；

6. 囊胚显微注射

① 用H-DMEM在30mm培养皿盖上做一个长滴和几个小圆滴，覆盖石蜡油；

② 将注射盘放在倒置显微镜台上，低倍镜下调整焦距至囊胚清晰，装持卵管，调节角度使其尽量处于水平位置，调整位置使其与受精卵在同一平面， 将注射针的平口端在酒精灯火焰上烧约2秒钟，安装在注射臂上并将内部空气排空，调整角度使其小于10度，调整位置使其与持卵针在一条线上；

③ 将放在4℃冰箱里的ES细胞吸10µl放入小圆滴，每次吸5枚囊胚放入注射长滴中，先用注射针在小圆滴中吸15枚ES细胞转至注射长滴，再用持卵针持住一枚囊胚后，转至高倍显微镜下，通过持卵管反复吹吸囊胚将其饲养层细胞间隙调清楚，位置合适为止，将注射针快速刺入胚腔内，慢慢将ES细胞注入胚腔，再慢慢退出注射针，一枚注射完毕后，再注射其它胚胎，如此反复进行；

④ 注射完后将胚胎吸入M16液滴中，清洗三遍，再培养三小时后待再次阔张。

6. 胚胎移植

① 准备好消毒的金属器械、缝合线等；

② 称重后按100ml/kg的剂量对小鼠实施1%戊巴比妥钠溶液麻醉，剪毛剪剪去小鼠背部被毛，70%酒精消毒后，在脊柱侧1cm，约与最后1 肋骨平齐处，剪开皮肤，用镊子沿切口钝性分离皮肤肌肉，用镊子轻轻拉出卵巢、输卵管和子宫，小夹子夹住部分脂肪，置于鼠背后皮肤上；

③用移植针吸入12枚注射后重新阔张的囊胚，吸入顺序为:M16 培养液&空气&M16培养液&囊胚，在保证胚胎完全吸入的情况下, 尽量增加培养液与空气的距离；

④将小鼠放在解剖镜下，用注射针在子宫角刺一小口，再插入移卵管，将囊胚吹入子宫内，切记不能吹入气泡；

⑤用钝镊子将脂肪垫、卵巢、子宫和输卵管一并送回腹腔，缝合腹膜及皮肤切口；

⑥用同样方法吸入胚胎然后移植，直到把注射后阔张的囊胚都移植入受体鼠体内，移植好的受体鼠单笼饲养屏障内；

⑦ 移植后做好标记，注明移植时间、注射细胞名称、胚胎数量。产仔后注明出生日期和出生数量，每天观察出生幼仔的存活情况。

7．鉴定

① 幼仔出生10天左右观察毛色，小于50%嵌合率的幼鼠及所有嵌合体雌鼠淘汰；

② 出生6周后与细胞同毛色雌鼠或特定小鼠1:1合笼，生出F1代后观察有无遗传，同时剪尾分子鉴定。

8. 器械准备
① 制作注射针

将玻璃管在拉针仪上固定好，调节最佳参数，点pull键将管子拉成两段，用剃须刀在17µm处切成有弧度的斜口或拉好的注射针放在煅针仪上测量，在17µm处断针。将磨针仪角度调整至30°，装上断好的注射针缓慢贴在砂轮上，匀速放水同时将速度开在100左右，一分钟后抬起注射针，插上洗针管后先在氢氟酸溶液里反复吹吸6次，再移置超纯水中反复吹吸至少30次，再在煅针仪上烧个30°的弯。

② 制作持卵针

将玻璃管在拉针仪上固定好，调节最佳参数，点pull键将管子拉成两段，持卵针拉好后用细砂轮在针直径为110µm左右处磨断或用煅针仪直接拉断（直径较粗对铂金丝损伤大），在煅针仪上向将管子的前端平口在玻璃球附近灼烧成内径为10µm左右，再将其打弯使其末端成30度。

③ 制作吸卵针和移植针

  点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约300µm做吸卵针，形成口径大约150µm做移植针，最后在酒精灯火焰上将断口钝化处理，注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。