1、化学去核（化学诱导和化学辅助去核）

◆ 小鼠超数排卵及GV期卵母细胞体外成熟（IVM）

 ICR雌鼠（6-8周龄）腹腔（IP）注射10IU PMSG（时间：8:00am）

                                   ↓46-48h later

     颈椎脱臼致死小鼠，取双侧卵巢于H-CZB中，30G注射器刺破大的有腔卵泡

  ↓

收集COCs/NO并在H-CZB液滴中洗涤几遍，移入IVM皿（平衡4h以上）培养5h，培养密度：10-20个/50μl

◆  卵母细胞去核和透明带消化

体外成熟5h后，机械吹吸COCs去除卵丘细胞（没有用Hya消化去除卵丘细胞）

↓

挑选GVBD卵母细胞（体视镜能观察到GVBD吗?）移入DC(0.4μg/ml)+KSOM培养2h

↓

移入DC(0.4μg/ml)+CHX(50μg/ml)+ KSOM培养12h (时间太长，尝试把时间缩短为3h)

↓

将排出PB1的卵母细胞移入Pronase(5mg/ml) 消化约2min去除透明带

↓

在KSOM液滴中洗涤3遍，移入KSOM液滴，37℃，5％CO₂培养(15h)待用

◆  粘合和融合

去核卵母细胞在KSOM中培养15h后（尝试把时间缩短为0～5h）

↓

卵胞质移入PHA (10μg/ml) + H-CZB粘合液滴中，37℃，2min

↓

移入H-CZB体细胞(卵丘细胞)液滴中，拨动卵胞质使其与体细胞粘贴，形成卵母细胞-体细胞复合体

↓

卵母细胞-体细胞复合体移入融合液（无Ca）中平衡2min, 立即转入电击槽电极间

↓

交流电5v/mm,3μs对复合体进行排队（10个/批），接触面平行于两电极间

施加直流电脉冲（92V/mm, 70us, 2次），静置1min

↓

复合体在KSOM液滴中洗涤2遍，快速移入KSOM液中培养20～30min后检查融合情况

↓

将成功融合的复合体移入Ca²⁺-free CZB+ CB(5μg/ml)中培养3h(防止电刺激后排出PB2极体,促进体细胞的重编程)

◆ 化学激活

将融合后培养3h的复合体移入激活液[Ca²⁺-free CZB+ SrCL₂(10 m M/L)+CB(5μg/ml)]培养6h

◆ 无透明带重构胚体外培养

激活后的重构胚在KSOM液滴中洗涤2遍后，移入WOW体系培养

（10个microwells/well, embryo density: 10个/500μl）

2、手工去核

◆ 小鼠超数排卵及MⅡ期卵母细胞收集

ICR雌鼠（6-8周龄）腹腔（IP）注射10IU PMSG（时间：5:00pm）

↓46-48h later

腹腔（IP）注射10IU HCG

↓16-18h later

颈椎脱臼致死小鼠，取双侧卵巢于H-CZB中，在体视镜下用1ml注射器（1号针头）将输卵管膨大部刺破，COCs团块和NO(自然裸卵)释放出来

↓

将COCs移入0.1％透明质酸酶静置2min,去除卵丘细胞，收集卵母细胞和卵丘细胞并在H-CZB液滴中洗涤几遍后，移入H-CZB待用

◆  卵母细胞透明带部分消化和手工去核

挑选排出PB1的卵母细胞置于H-CZB液滴中

↓

将排出PB1的卵母细胞移入Pronase(5mg/ml)消化部分透明带（要保证消化后极体还存在），注意控制消化时间（20个/次）

↓

快速将透明带部分消化的卵母细胞移入体外操作液CB(5μg/ml)+ H-CZB液滴中，用胚胎分割刀沿PB1方向将卵母细胞1/3切除，卵胞质移入H-CZB液滴待用

↓

将切割后的卵胞质移入Hoechst33342/33258(5μg/ml)染色5-10min,在UV光下观察记录去核率（可以省略）

◆  粘合和融合

手工去核卵胞质移入PHA (10μg/ml) + H-CZB粘合液滴中，37℃，2min

↓

移入H-CZB体细胞(卵丘细胞)液滴中，拨动卵胞质使其与体细胞粘贴，形成卵母细胞-体细胞复合体，再将复合体转入H-CZB液滴中，等待融合

↓

卵母细胞-体细胞复合体和另一半卵胞质移入融合液（无Ca）中平衡2min（10个/批）

↓

迅速将复合体和另一半卵胞质移置融合槽的北面和南面，交流电5v/mm,3μs对复合体进行排   队（10个/批），接触面平行于两电极间，同时将另一半胞质与复合体粘贴构成“三明治” 形状（当心拨掉体细胞），最后，施加直流电脉冲（92V/mm, 70us, 2次），静置1min

↓

将复合体快速移入KSOM液滴中洗涤几遍，并培养1-3h(促进体细胞核重编程),检查融合情况

◆ 化学激活

将培养1-3h成功融合的重构胚移入激活液[Ca²⁺-free CZB+ SrCL₂(10 m M/L)+CB(5μg/ml)]培养6h（开始记录培养的日期）