IVF protocol_爱贝生物

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IVF protocol

体外受精技术资料 2021-01-14

实验试剂

MEM+BSA+10%FBS	自己配置:10%为体积分数，如将1.5mlFBS成品加入13.5ml的MEM+BSA
矿物油	sigma（M8410-100ML）
胚胎培养液KSOM	millipore（MR-020P-F）
透明质酸酶（Hyaluronidase）	sigma（H4272），30mg干粉（0℃以下储存）加入3ml M2溶液，配制成10mg/ml的高浓度储存液（10X），取出100ul的10X储存液加入900ul M2 培养液即为1mg/ml的工作液，分装成100ul/管，使用时每只母鼠50ul，液体全部-20℃保存
培养条件	37℃，5%CO2，5%O2，90%N2

实验步骤

●第一天：晚9点供卵雌鼠注射PMSG，3W小鼠5UI/只，2M以上小鼠10UI/只。已提前配制好***UI/ml的PMSG和hCG。

●第三天：46-48h后约晚7点注射hCG，3W小鼠5UI/只，2M以上小鼠10UI/只。

●第四天：在注射hCG后14-16h进行受精，最好不超过15h，约第四日早9点-11点杀鼠取卵。

分类	容量	试剂	是否覆油	备注
附睾采集皿	2.5ml	MEM+BSA
精子获能皿	900ul	MEM+BSA	覆油	受精前1h
卵子采集皿	2.5ml	MEM+BSA+10%FBS
卵子清洗皿	2.5ml	MEM+BSA+10%FBS
受精皿	490ul	MEM+BSA	覆油
1cell清洗皿	200ul	MEM+BSA	覆油	受精后4-6h
发育培养皿	50ul	KSOM	覆油	受精后1D，提前过夜覆盖矿物油平衡
注意	1.如果不需要消化卵丘细胞，可不加FBS。FBS是用来保护透明带，防止其硬化！！！1cell清洗皿要做俩个滴 2.除KSOM培养皿外，均在操作前提前30m-1h预平衡。因覆盖石蜡油后预平衡易产生气泡，可先预热试剂再覆油

●准备获能精子：因精子需提前获能一小时，需要提前一个多小时杀F1公鼠。在注射hCG后12-13h处死雄鼠，迅速分离输精管和附睾尾，尽可能取出脂肪和血管，用镊子和30号针头切附睾尾6-7下，放入精子获能皿，置于37℃温育1h。

●准备卵细胞：提前30m准备卵子采集皿、卵子操作皿，剪取卵巢、输卵管和小部分子宫，镜下用注射针头切出2个输卵管，挑入50ul（1mg/ml）的透明质酸酶滴，用针头切开壶腹部，挤出排出的卵丘细胞团，在酶滴中消化1-2min，直至卵丘细胞完全脱落，然后用口吸管将卵转入卵子清洗皿中洗去透明质酸酶和杂质。记录卵的时期及个数，见表1。

●受精：将事先准备好的490ul受精滴加入10ul精子，并将含第二极体的卵转入受精滴，立即放入培养箱，开始计时。

●清洗1cell：4-6h观察并记录原核数量，/将所有卵或受精卵转移至新的1cell清洗皿（200ul），石蜡油覆盖。

●观察：受精24h后观察并记录2-cell的数量，转入新的50ul KSOM培养液滴中，此后不再换液。每隔24h观察并照相，记录生长状态。

取卵记录表格1：

ID	GV或GVBD（含生发泡）	M II（含第二极体）	Total
1
2

受精卵发育表格2：

ID	4-6h	8h	24h	48h	72h	96h	120h	比例
	原核	1-cell	2-cell	4-cell	8-cell	囊胚	囊胚孵化	各期数/2-cell数
	第一天	1-cell	第二天	第三天	第四天	第五天	囊胚孵化	各期数/2-cell数
1
2